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蛋白质的结构与功能
1、蛋白质结构与功能的关系：
从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。脊椎动物中血红蛋白在血液中起到载氧和输氧的作用，肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。
(一)肌红蛋白（Mb）的结构与功能
（1）三维结构：
由一条多肽链和一个血红素辅基构成，相对分子量16700，含153个氨基酸残基。分子中多肽链由8段α-螺旋组成，分子结构致密结实，带亲水基团侧链的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部。
（2）辅基血红素：
由二价铁和原卟啉Ⅸ组成，原卟啉Ⅸ由4个吡咯环组成。铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素基，保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。结合氧只发生暂时电子重排。
(二)血红蛋白(Hb)的结构与功能
（1）血红蛋白由4个多肽链（亚基）组成，如α2β2（成人血红蛋白HbA），每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位，α-链有141个残基，β-链有146个残基，且α链、β链和Mb的三级结构都非常相似。实际上对于人的这三种多肽链分析发现只有27个的残基是共有的，这表明蛋白质高级结构的保守性。只要功能相同（都与氧结合），高级结构就相似，有时甚至是唯一的。
血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体，，而肌红蛋白只有三级结构。因此血红蛋白运载氧能力增强，还能运载H+和CO2，在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且Hb为变构蛋白，可受环境中其他分子，如H+，CO2和2，3-二磷酸甘油酸（BPG）的调节。
（2）氧结合引起血红蛋白构象变化，氧合血红蛋白和去氧血红蛋白在四级结构上有显著不同，发生构象变化。氧与血红蛋白结合是协同进行的，具有正协同性同促效应，即一个氧分子与Hb结合，使同一Hb分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加，再结合第二、三、四个氧分子则比较容易。
(三)血红蛋白分子病
人类已发现300多种不同突变的血红蛋白，许多突变是有害的，产生遗传病，如镰刀状细胞贫血症：
病状：贫血症；
检查：血液中含大量镰刀形红细胞HbS，没有足够可承担输氧的正常圆形细胞HbA。镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。
研究：电泳发现HbS和HbA电泳速度和等电点均有差异。在pH8.6下均向正极移动，但HbS比HbA稍慢，说明HbS比HbA少几个带负电荷基团。
氨基酸测序发现HbA与HbS区别在于β-链上6-位Glu（HbA）变为Val（HbS），结果由于疏水相互作用，β-链上6-Val与1-Val接近，使血红蛋白分子从扁平状压缩变形，形成细长聚集体红细胞，构成镰刀形，与氧结合力降低。
值得注意的是血红蛋白分子四条肽链共574个氨基酸残基，只两个β-链上的氨基酸被代替（2Glu→2Val），即引起如此严重疾病。
2、蛋白质分离和纯化
(一) 蛋白质分子量测定：
（1）根据化学组成测最低分子量：
1. 肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分别求它们的最低分子量：
肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335×100=16700，与其他方法测分子量相符。
血红蛋白含铁也是0.335%，最低分子量也为16700，但用其他方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有4个铁原子，由此计算更为准确分子量为：16700×4=66800。
2.由氨基酸含量计算：
如牛血清清蛋白含Trp0.58%，蛋白质最低分子量为35200；每一牛血清蛋白含有2个Trp，所以分子量为70400，比其他方法测出的准（69000）。
（2）沉降系数和沉降系数单位：
蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。
沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或沉降常数用s表示。
s常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10-13到200×10-13sec范围。
为方便起见，把10-13sec作为一个单位,称为svedberg（斯维得贝格）单位或沉降系数单位，用S表示，如人的Hb沉降系数为4.46S，即为4.46×10-13sec。
(二)蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀：
蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小1~100nm。
蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如三氯乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。
(三)蛋白质的分离纯化：
（1）前处理：
将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释放出来，并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质，离心除去杂质。
（2）粗分离：将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、核酸和多糖等。
1.等电点沉淀和pH控制：
等电点沉淀：改变蛋白质溶液pH，使蛋白质净电荷为零处于等电点，相邻蛋白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。
由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。
2. 盐溶和盐析：
盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度下降并进一步析出。
盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。一般用硫酸铵盐析，硫酸铵在水中溶解度高，且溶解度的温度系数较低。
盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质溶解度增加。
（3）细分级分离：
一般用层析法和电泳法。
1.电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子）
将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。
电泳迁移率或泳动度（μ）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液中的移动速度。
μ = υ/E υ：颗粒泳动速度，E：电场强度
常用的电泳种类：
①区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。
②薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。
③凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
④毛细管电泳（HPCE）：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和区带变宽；系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。
⑤等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处，聚集成很窄的区带。
分辨率高，适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子。
pH梯度制作：可利用两性电解质，已有商品出售。
2.亲和层析：是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法，可一步提纯。
根据生物分子与特定固相化配体（Ligand）之间的亲和力不同，而使生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析。
例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上（如琼脂糖），制成专一吸附剂，并装在层析柱中。当含有这种酶的溶液通过层析柱时，酶就会被吸附，而其他蛋白质则不被吸附先流出；然后再用适当缓冲液将吸附在柱上的酶洗脱下来。
（4）结晶：
结晶为蛋白质纯度一个标志，也是判断制品处于天然状态指标。蛋白质纯，则易结晶，为分离提纯最后步骤。
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