|
每周考点 华工考研每周考点：主要是华工各专业考研核心考点，帮助大家快速把握考试关键，进行快速查缺补漏。
相关科目：830生物化学 相关知识点：蛋白质一级结构测定
#1、蛋白质一级结构测定 测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基酸数目、类型和顺序。
蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的，是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。
（一） 蛋白质测序 样品纯度应>97%，测分子量（允许误差10%）。
1. 蛋白质分子中多肽链的数目：测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。 2. 每一多肽链氨基酸组成：鉴定N-末端残基和C-末端残基，定出氨基酸序列参考点。 3. 按专一方式断裂成较小的肽片段：可用酶或化学方法完成，并用多种断裂方法，将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。 4. 侧各肽段氨基酸序列：常用Edman降解法，用自动序列分析仪。 5. 测定片段次序：用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。 6. 确定二硫键位置。
（二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定
（1）N-末端分析 ① 二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：Sanger反应。 2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂，与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质，再酸性水解生成DNP-氨基酸（黄色），提取分离后可进行鉴定和定量测定。 此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 ② 丹磺酰氯（DNS）法：有荧光，灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯（DNS），结构式见170。 ③ Eman降解 苯异硫氰酸酯 (PITC) 法：Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。 PITC与多肽链每反应一次，得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。 PTH (phenylthiohydantoin)：苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。 ④ 氨肽酶法： 用外切酶，从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶，适用于N-末端残基的氨基酸被封闭的肽（如环肽）；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨肽酶。
（2）C-末端分析 ① 肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应，除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键而不易与-COOH反应，肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。 ② 还原法：用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。 ③ 羧肽酶法：专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸。
（三）二硫键断裂： 用变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，分子内部-S-S-露出，并用HSCH2CH2OH处理，则-S-S-变成2个-SH，再用碘乙醇保护-SH不被氧化。 也可用过甲酸氧化，将-S-S-变成2个磺酸基。
（1） 氨基酸组成分析： 可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解（6mol/L HCl），再用碱水解测Trp。 测出Asx和Glx，酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。 P172 表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。
（2） 多肽链部分裂解成小肽段，分别测序： 现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分离后测序。 （1） 酶裂解法：常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）： 胰蛋白酶：水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键，如Lys，Arg。 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽键羧基端为芳香族氨基酸，如Phe、Trp、或Tyr，以及疏水氨基酸Leu、Met或His。 胃蛋白酶：特异性不太强，切点多，肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。 （2） 化学裂解法：溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键，生成肽酰高丝氨酸。
（四） 肽段氨基酸序列测定 （1） Edman化学降解法： 每反应一次生成一个PTH-AA，层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链，又有新N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅5 pmol。 Edman降解现已有多种改进。如DNS-Edman测序，可提高灵敏度；试剂的改进，用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。 （2） 质谱法：电喷射电离（ESI）。使蛋白质离子解吸进入气相，15肽以下均可用。
（五） 肽段在多肽链中次序确定 用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位，可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）确定肽段先后次序，从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。
（六） 二硫桥位置的确定 用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成比较小的含二硫桥的肽段混合物，将样品点在滤纸中央，在pH6.5进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏，-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸（带负电荷）的肽。将滤纸转900，在完全相同条件下再进行第二向电泳，大多数肽段迁移率未变，位于滤纸对角线上，而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线（向正极向）。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推出二硫桥的位置（肽链内或肽链间）。 现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的，但仍需氨基酸序列分析配合。
加入华工考研各专业【微信交流群】 请加微信号：scutky8(备注年份+报考专业），获取免费直播课入场链接
| 
